Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 细胞增殖-毒性检测试剂盒

(100孔，500孔，1,000孔，3,000孔以及10,000孔的规格)

注意事项：

1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数 量和加入CCK- 8试剂后的培养时间。
2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下 来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔 就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为 了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而 不作为指标检测孔。
3. 培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多 少而异。一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长 的CCK- 8反应时间或增加细胞数量 (～105个细胞/孔)。 悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞， 在加入CCK- 8培养1- 4小时后，可先从培养箱中取出， 目测染色程度或用酶标仪测定决定。若显色困难，可 将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。对 于贴壁细胞，CCK- 8的培养时间一般为1- 4小时，但 在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度 (根据 细胞种类而定，需要摸索一下条件)。注意：CCK- 8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。
4. 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平 行孔间的差异。加 CCK- 8试剂时，建议斜贴着培养 板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡， 会干扰O.D值读数。
5. 加 CCK- 8试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的 残留。为使CCK- 8试剂和培养基充分混匀，建议在加 入CCK- 8试剂后轻轻振摇培养板。为了避免加样时由 于CCK- 8试剂在枪头上的残留所带来的误差，可以在 加样前用培养基稀释CCK- 8试剂并混匀后加样。
6. CCK- 8试剂中的WST®- 8会与还原剂反应生成WST® - 8甲臜，如果实验中有还原剂，请检查背景的O.D值， 即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK- 8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比 较 (只加CCK- 8试剂)，如果O.D值明显偏高，则说明 有反应。
7. 若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生 变化，建议更换新鲜的培养基后再加CCK- 8试剂。含 有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。
8. 如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议设定600 nm (或 600 nm以上) 作为参比波长，扣除参比波长的O.D值即可。
9. CCK- 8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱 氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，O.D值不断增加 (注：活细胞内的脱氢酶是持续产生的 ) 。另外，其他 的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在CCK- 8法 检测完后继续进行。
10. 如果要测定细胞的具体数量，建议先做一个标准曲 线 ( 具体方法参见P.3页的"制作标准曲线")。

试剂内含

100 孔	1 ml x 1 管
500 孔	5 ml x 1 瓶
1,000 孔	5 ml x 2 瓶
3,000 孔	5 ml x 6 瓶
10,000 孔	100 ml x 1 瓶

贮藏条件

CCK- 8在避光0- 5℃的条件下可以存放1年，在- 20℃条件 下可以贮藏更久。反复解冻和冷冻会增加背景值，干扰实 验测定。如需经常使用请将试剂存放在0-5℃的条件下。

所需设备和材料：

• 10 ml、100-200 ml以及多通道移液器
• 带有450 nm滤光片的酶标仪
• 96孔培养板
• CO2培养箱

概述

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 利用了Dojindo开发的水 溶性四唑盐 — WST®-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它 在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原 成水溶性的甲臜染料,如图.1所示。

专利号：WO97/38985

CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中；不需要预配 各种成分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验 中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测 法。WST®-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄 色甲臜染料能够溶解在组织培养基中 (如图.2所示)， 生成的甲臜量与活细胞数量成正比。

操作说明

制作标准曲线

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细 胞数量，然后接种细胞。
2. 按比例 (例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀 释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞 浓度梯度，每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK -8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一 条以细胞数量为横坐标 (X轴)，O.D值为纵坐 标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测 定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的 前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞 的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间)。

细胞活性检测

1. 在96孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 )。将培养 板放在培养箱预培养 (在37℃，5% CO2的条件下)。
2. 向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液 (注意不要在孔 中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
3. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可 以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。 在24小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖-毒性检测

1. 在96孔板中配制100 ml的细胞悬液。将培养板在 培养箱预培养24小时 (在37℃，5% CO2的条件下)。
2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6, 12, 24或48小时)。
4. 向每孔加入10 ml CCK-8溶液 (注意不要在孔中生 成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
5. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可 以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。 在24小时内吸光度不会发生变化。注意：如果待 测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之 前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物 影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除 培养基中加入药物后的空白吸收即可。

Q&A:

1. 每孔应该接种多少细胞？

   贴壁细胞每孔至少需要接种1,000个细胞 (100 ml的培养基)，检测白细胞时由于它的灵敏度较低，每孔至少需要接种2,500 个细胞 (100 ml的培养基)，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。如果要使用24孔板或是6孔板实验，请先计算每孔相应 的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK- 8溶液。

2.  

    

3. 如何设定空白对照？

   在不含细胞的培养基中加入CCK- 8，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验 (细胞毒性实验) 时，还应考虑药 物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK- 8，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

4. 哪些物质会影响CCK- 8的测定？

   当有还原性物质存在时会影响CCK- 8的测定，增加O.D值；在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，减小O.D值； 在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

5. 在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

   有时会有影响。如果药物具有还原性，就会和CCK- 8试剂发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否 有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK- 8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (只加CCK-8) 的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK- 8之前更换培养基，去掉药物的影响。

6. CCK- 8对细胞的毒性大小如何？

   CCK- 8对细胞的毒性相当低，同样的细胞在CCK- 8法检测后还可用于其他细胞增殖的检测实验，如结晶紫检测法，中性 红检测法或DNA荧光检测法等。

7. CCK- 8的保质期有多久？

   CCK- 8在避光0-5℃的条件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要长期保存，我们推荐在-20℃储藏。 在常温下可以保存3周左右，颜色应该为浅红色，如果颜色发生改变，则可能会增加空白吸光度。

8. 我没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他的滤光片？

   您可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。

9. CCK- 8能否对活细胞进行染色?

   不能。因为CCK- 8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST®- 8)，并通过电子载体1- Methoxy PMS将活细胞中的电子交 换到培养基中的WST®- 8上，因为WST®- 8及其生成的甲臜染料是高度水溶性的，不会进入细胞内，所以CCK- 8不能对 活细胞进行染色。

10. 必须设定参比波长吗？设定的目的是什么？

    不一定要设定，CCK- 8试剂在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。

11. 如果O.D值太低，可以采取什么办法？

    可以采取2个办法： ① 适当增加细胞数量。 ② 延长加入CCK- 8试剂后的染色时间。